Precies in dat jaar bouwde Hendrik Niehoff een nieuw orgel. Bij de Beeldenstorm bleek dat geen beschadiging opgelopen te hebben. Een ander orgel wel. Bij de verwoesting daarvan riep een rabauw uit: „Zij hebben mij het zingen verboeden, ick sal hen het pijpen verbieden.” Het Niehofforgel in Den Bosch ging echter in 1584 verloren. ’t Ging door hemelvuur in vlammen op, net nadat in de Sint-Jan een dienst was gehouden uit dankbaarheid vanwege de moord op Willem van Oranje.

In de jaren 1617-1620 werd de rijkbewerkte orgelkast van het huidige orgel gemaakt door schrijnwerker Frans Simonsz en beeldhouwer Georg Schysler. Het pijpwerk was van Florentius Hoque uit Grave, maar werd 1634 verbeterd door vader en zoon Hagerbeer, waarbij een keurmeester uitriep: „Dat ons orgel alle orgels hier in Nederland te boven ging.” Nadat het instrument in verval raakte, maakte de Nijmegense orgelbouwer Heyneman met gebruikmaking van oud pijpwerk een totaal nieuw exemplaar in de oude kast, gedurende 1784-1787.

Op dit orgel, dat 43 sprekende stemmen telde, heeft in 1789 de Duitse componist Georg Joseph Vogler gespeeld, een tijdgenoot van Mozart. Hij was onder andere de leermeester van componist Carl Maria von Weber. De intree bij dat concert, waarin hij eigen werk speelde, bedroeg een gulden. Wanneer men na de pauze kwam –de orgeltrappers hadden immers ook hun rust nodig– behoefde men maar 11 stuivers neer te tellen. Toch forse bedragen in die tijd.

Ruim een eeuw later werd het orgel opnieuw verbouwd door de gebroeders Franssen uit Roermond. Het aantal stemmen vermeerderde tot 66 met een pneumatisch systeem. Het orgel werd op 24 februari 1902 plechtig ingewijd. De bespeling werd verzorgd door de eigen organist, Pieter Kallenbach, en de organist van de Mozes en Aäronkerk te Amsterdam, Jos. A. Verheyen. In het programma voor de inwijding, dat men voor 0,25 cent kon kopen, is te lezen dat op het orgel van de Laurenskerk te Rotterdam na, het Bossche het grootste was van Nederland.

Toen in 1953 de orgelbouwer Verschueren het nog eens onder handen nam, werd het uitgebreid tot een instrument met 72 sprekende stemmen. Het was toen het grootste, want het Laurensorgel was in mei 1940 bij het Rotterdamse bombardement in vlammem opgegaan. Niet lang heeft dat record geduurd, want de Laurens kreeg in 1973 een orgel met maar liefst 85 sprekende stemmen, terwijl de firma Flentrop in 1983 het orgel van de Sint-Jan restaureerde in de oude stijl, waarbij het aantal stemmen gereduceerd werd tot 49. Een kerkorgel dient geen prestigekwestie te zijn.

Dat ondervond eens plebaan Brouwer. Het Bossche orgel had weer een grote opknapbeurt gehad en er zou een orgelbespeling worden gegeven waarbij de plebaan, trots op het resultaat, allerlei hoogwaardigheidsbekleders had uitgenodigd. Het concert begon en een toon bleef hangen. Het euvel kon niet worden verholpen en het concert werd afgelast. De oorzaak bleek uiteindelijk een muizenkeuteltje te zijn. De plebaan reageerde: „Ik dank U, Heer, dat Gij mij vernederd hebt.”