Timosjenko speelde toen een hoofdrol in de vele protestacties in de weken na de chaotisch verlopen tweede ronde van de presidentsverkiezingen. Zij leidde een massabetoging van tienduizenden Oekraïners door de straten van Kiev om tegen fraude en kiezersbedrog te protesteren. Het protest leidde ertoe dat de prowesterse oppositieleider Viktor Joesjtsjenko begin 2005 alsnog werd beëdigd als president.

Timosjenko geldt als radicaal en charismatisch, en is populair onder nationalisten. De 53-jarige met haar lange haarvlecht werd regelmatig eerste als Oekraïense media een lijstje met de knapste vrouwen presenteerden. Ze staat graag in de schijnwerpers en heeft er geen enkele moeite mee de leiding op zich te nemen.

Nadat Joesjtsjenko mede dankzij haar staatshoofd was geworden, leverde haar dat in januari 2005 dan ook voor de eerste keer het premierschap op. Met haar sociale beleid raakte zij echter snel in conflict met Joesjtsjenko die meer oog had voor de belangen van het bedrijfsleven. Na slechts 8 maanden werd zij al weer ontslagen als regeringsleider.

Van 2007 tot 2010 was zij opnieuw premier. Bij de verkiezingen in 2010 deed zij een gooi naar het presidentschap, maar moest het afleggen tegen Viktor Janoekovitsj, de huidige president. Het jaar erop werd zij opgepakt en tot 7 jaar cel veroordeeld wegens ‘machtsmisbruik’. De EU veroordeelde het proces scherp. Velen in het Westen zagen de berechting van Timosjenko als een poging van Janoekovitsj om een politieke tegenstander uit te schakelen. Uit protest tegen haar voorwaarden van detentie ging Timosjenko enige tijd in hongerstaking.

Timosjenko was voor haar politieke loopbaan al in Oekraïne bekend als de gasprinses. Ze kreeg deze bijnaam wegens haar activiteiten in de gasindustrie.